RNA m6A修饰相关检测

服务简介：m⁶A是指腺嘌呤核苷 N6 位置发生了甲基化修饰，是mRNA上最丰富的甲基化修饰，m⁶A甲基化修饰主要受METT3/METTL14酶调控。研究显示m⁶A目前主要发生在终止密码子附近和基因内部较长的外显子中，影响mRNA的稳定性，翻译效率，可变剪接和定位等。此外，长非编码RNA以及microRNA等非编码RNA也存在m⁶A位点。目前检测m⁶A所用的技术手段包括高通量测序、比色法以及液相色谱质谱联用（LC-MS），具体方法包括MeRIP-seq、miCLIP-seq、LC-MS/MS等。以下是目前较为主流的四种检测m⁶A的方法，其中LC-MS/MS和比色法能够检测mRNA整体的m⁶A水平，而m⁶A-seq和miCLIP-seq属于高通量测序手段。

一、LC-MS/MS: LC-MS/MS在液相质谱的基础上采用串联质谱，能够获得分子离子峰和碎片离子峰，可对碱基同时进行定性和定量分析。

服务流程:

(1) 获取高质量（有明显的18S或28S主带，且条带清晰；RNA的完整性，RIN值不低于7.5）、高浓度（总RNA 检测总量不低于10µg）的total RNA

(2) oligodT磁珠对mRNA进行富集，或使用rRNA去除试剂盒获得包括mRNA、lncRNA等在内的RNA

（3）使用核酸酶P1（Nuclease P1）将RNA从单链消化成单个碱基

（4）样本注射入液相色谱仪，计算各个碱基的含量

（5）计算m⁶A的面积，最后根据m⁶A和总腺嘌呤的比例就能算出m⁶A在mRNA上整体的甲基化程度。

二、比色法：与LC-MS/MS比较相似，也是从整体水平上检测RNA上m⁶A甲基化水平。相对于LC-MS/MS较为繁琐的操作，比色法更为简便。研究人员既可以提取total RNA，也可以利用oligodT磁珠富集mRNA。之后利用m⁶A定量检测试剂盒进行检测。

服务流程:

（1）获取高质量（有明显的18S或28S主带，且条带清晰；RNA的完整性，RIN值不低于7.5）、高浓度（总RNA 检测总量不低于10µg）的total RNA

（2）参照m⁶A定量检测试剂盒说明书进行

三、MeRIP–Seq（m⁶A RNA immunoprecipitation，或m⁶A-Seq）：首先通过m⁶A特异性的抗体进行免疫沉淀富集，然后通过高通量测序的方法进行分析，以检测发生m⁶A修饰的RNA转录本。该方法可将m⁶A残基定位在100-200nt的转录本区域中，无法在全转录组水平上鉴定m⁶A的精确位置。

服务流程:

（1）获取高质量（有明显的18S或28S主带，且条带清晰；RNA的完整性，RIN值不低于7.5）、高浓度（总RNA 检测总量不低于10µg）的total RNA

（2）RNA片段化

（3）m⁶A特异性的抗体进行免疫沉淀，得到富集的RNA

（4）高通量测序

四、miCLIP（m⁶A individual-nucleotide-resolution Cross-Linking and ImmunoPrecipitation）：含有m⁶A的RNA与相应抗体结合以后，通过紫外进行交联，反转录得到的cDNA会出现突变或者截断，这样就可以指示m⁶A的存在。该方法的分辨率为单核苷酸水平。

服务流程:

（1）获取高质量（有明显的18S或28S主带，且条带清晰；RNA的完整性，RIN值不低于7.5）、高浓度（总RNA 检测总量不低于10µg）的total RNA

（2）RNA片段化

（3）使用带有m⁶A抗体免疫磁珠与带有m⁶A的mRNA片段进行结合

（4）使用紫外交联进行免疫共沉淀,蛋白酶K处理，反转录

（5）构建测序文库上机测序

说明：

（1）服务周期：10-20工作日

（2）客户需提供高质量（有明显的18S或28S主带，且条带清晰；RNA的完整性，RIN值不低于7.5）、高浓度（总RNA 检测总量不低于10µg）的总RNA，或者实验方案

（3）客户需提供m⁶A抗体（或委托我公司代购）

（4）如选择试剂盒检测，请提供相关试剂盒（或委托我公司代购）

费用标准：询价