双荧光素酶报告基因通常以萤火虫荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因。由此构成的报告系统具有灵敏度高、检测范围广、应用灵活等优势，广泛应用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。

技术原理

将目的基因转录调控原件构建入带有荧光素酶(Firefly luciferase)的表达载体，构建成报告基因质粒，使这段序列调控luciferase的转录表达。然后将报告基因质粒转染细胞，给予其不同的处理后裂解细胞，并加入底物荧光素(luciferin)，luciferase可催化luciferin发出荧光(最强波长在560nm左右)。检测得到的荧光值高低可以判断不同处理组对该转录调控原件的影响。为避免由于质粒转染细胞时效率差异所造成的误差，通常会转入Renilla luciferase的报告基因质粒作为内参(最强波长在465nm左右)，即双荧光报告系统。

荧光素酶介绍及作用原理

1、萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase，FLUC）

萤火虫荧光素酶催化的发光反应原理为在ATP、Mg2+和O2存在的条件下，虫荧光素在虫荧光素酶的催化下氧化发光，发光颜色为黄绿色。

图1. 萤火虫荧光素酶催化反应原理    

      萤火虫荧光素酶一般是作为主报告基因，将目的基因构建在该载体上，从而反应目的序列的作用结果，因此根据我们的实验目的，可以针对此质粒进行改造，载体的工作原理如下图所示：

图2. 萤火虫荧光素酶载体工作原理

2、海肾荧光素酶（Renilla luciferase，RLUC）

海肾荧光素酶催化的发光反应需要腔肠素和O2的参与，发光颜色为蓝色。

图3. 海肾荧光素酶催化反应原理

海肾荧光素酶通常作为内参报告基因，在实验操作的过程中，常遇到由于个人操作造成的实验误差，比如细胞数目不均一、细胞代次不统一、转染效率不一致等。引入一个内参报告基因，以此来标定检测用报告基因的测量结果，从而达到有效地减少实验误差的目的，载体的工作原理如下图所示：

图4. 海肾荧光素酶载体工作原理

双荧光素酶报告系统的应用

1、验证microRNA同mRNA靶向互作。将待测基因的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，检测荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。

图5. 靶向互作模式图

2、验证microRNA同lncRNA靶向互作。将待测lncRNA序列插入报告基因载体的3’UTR区域，检测荧光素酶活性。

3、验证特定转录因子同其调控序列的作用。将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。

图6. 启动子-转录因子调控模式图

4、启动子结构分析。将启动子区域(约2k左右)进行分段截短或突变，构建入报告基因载体，检测荧光素酶活性。

5、启动子SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。

6、验证信号通路是否激活。将该信号通路的下游相应原件序列构建入报告基因载体，检测不同上游条件下，其荧光素酶活性，即下游信号通路的响应情况。

7、活体荧光成像。将荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光素酶也会得到持续稳定的表达。基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。将标记好的细胞接种到实验动物体内后，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。

双荧光素酶报告基因主要实验流程

1、报告基因质粒的构建。

将目的片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体上，如pGL3-basic。

2、转染细胞。

将报告基因质粒和phRL-TK(内参)共转染细胞，根据需要对细胞进行处理。共转染时，由于内参具有很强的启动子，因此报告基因质粒：内参转染量一般为10:1~50:1。

3、Luciferase活性测定：

     ⑴ 初次使用时，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。将LAR II溶解在LAR II buffer中，并分装-80℃避光保存。

     ⑵ 加入1X PLB，室温裂解细胞15 min。

     ⑶配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，能够终止LAR II的反应。

     ⑷ 测定荧光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul细胞裂解液，吹打混匀后，检测读数，即为Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次读数，即为Renilla luciferase的值。

     ⑸ 数据处理。首先计算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control组的比值为单位1，即可得到不同处理组的相对luciferase活性，也就是该处理组基因转录的调控活性。

案例共享

01

作者通过表达分析发现了一条肌肉发育相关的lncRNA---lnc-MD1.前期功能研究发现lnc-MD1可以调控肌肉分化的时间。信息学分析发现这条肌肉特异的lncRNA上包含36个miRNA的结合位点。如果只考虑肌肉发育相关的miRNA和基因，36个候选miRNA里面只剩下miR-133和miR-135。作者通过荧光素酶实验进行了验证。首先作者把野生型及其缺失miR-133和miR-135结合位点的Lnc-DC1克隆到进R-Luc的3’UTR，然后分别与表达miR-133和miR-135前体的质粒共同转染到细胞进行荧光素酶活性检测（图A、B）。证明lnc-MD1缺失存在miR-133和miR-135的结合位点。

进一步的信息学预测，miR-133和miR-135分别靶向两个基因- MAML1 和 MEF2C。同样，作者还是通过荧光素酶实验进行验证。研究者把MAML1 和 MEF2C的3’UTR （WT）和miRNA结合位点缺失突变体（-mut）分别克隆在RLuc表达框的下游，然后和miRNA过表达载体共转染细胞进行酶活测定。结果显示miR-133和miR-135确实分别靶向了MAML1 和 MEF2C两个基因（图C）。最后的模型是lnc-MD1通过ceRNA机制吸附miR-133和135，正向调控了MAML1 和 MEF2C的表达，参与调控肌肉发育。

02

作者通过芯片鉴定出DC (树突状细胞)发育相关的一个lncRNA，命名为lnc-DC。同时高通量测序也发现了这条差异lncRNA的存在。进而作者通过Northern Blot验证了这条lnc-DC。由于lnc-DC极其特异和稳定地高表达在DC发育过程的某一时期，所以作者假设lnc-DC可能是和表观遗传学调控事件相关的。为了验证这一假设，作者通过染色体免疫沉淀结合测序的技术-CHIP-seq和qPCR发现lnc-DC的转录起始位点（TSS）附近富集了Pol II、H3K4me3和H3K27ac等蛋白（图A），提示DC发育过程中表观遗传学变化与lnc-DC的转录增强事件相对应。进而作者通过序列分析发现在lnc-DC的转录起始位点附近（+44-+50）存在一个经典的PU.1结合位点。作者假设PU.1参与了lnc-DC的特异性表达。于是作者设计了如下实验进行了进一步的验证（图B）。

作者把lnc-DC的启动子区段（-1447-+223）及其不同的突变体版本分别克隆到F-Luciferase表达框上游，然后和转录因子PU.1表达质粒或者空载体（Vector）共同转染到模式细胞系HEK-293T，通过测量荧光强度的变化间接反应转录活性的高低。最终证明转录因子PU.1通过经典结合位点（+44-+50）介导了lnc-DC在DC发育过程中的特异表达。

03

本文中，作者鉴定出一个表达量较高的环状RNA分子-circHIPK3. circHIPK3来源于基因HIPK3第二个外显子。RNAi干扰circHIPK3可以影响细胞的生长。为了进一步研究其机制，作者通过序列分析发现circHIPK3含有一些列miRNA结合位点。为了从中筛选出真正的miRNA，作者构建了基于荧光素酶的筛选系统---把circHIPK3构建到Luciferase的3’UTR区域，然后分别与424个miRNA mimics共转染到模式细胞系HEK-293T内进行筛选验证，最终作者筛选出9个候选的miRNA。通过功能试验和共表达分析进一步验证得到mir-124是阳性候选miRNA。最终作者证明circHIPK3通过吸附miR-124正向调控了其靶基因IL6R 和 DLX2的表达，影响了细胞的生长。

04

已知IL-1β在许多慢性和急性炎症疾病中起着重要作用，本文作者为了了解IL-1β在疾病发展过程中的作用，进行了抗炎药物的体内筛选系统，作者通过显微注射技术构建了受人IL-1β启动子调控的Luciferase转基因小鼠，在LPS注射刺激后的不同时间点分别进行背部以及腹部成像检测，观察小鼠整体荧光表达变化，并且能够模拟内源性IL-1β变化趋势。最终表明，转基因小鼠模型可用于研究炎症过程中IL-1β基因表达的转录调控，并在体内评价抗炎药物的作用。

参考文献

[1] Cesana M, Cacchiarelli D, Legnini I,et.al. A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA. Cell. 2011 Oct 14;147(2):358-69. doi: 10.1016/j.cell.2011.09.028.

[2] Wang P, Xue Y, Han Y,et.al.The STAT3-Binding Long Noncoding RNA lnc-DC Controls Human Dendritic Cell Differentiation.Science. 2014 Apr 18;344(6181): 310-313.DOI: 10.1126/science.1251456.

[3] Zheng Q, Bao C, Guo W, et.al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nat Commun. 2016 Apr 6;7:11215. doi: 10.1038/ncomms11215.

[4]Li L, Fei Z, Ren J, et.al. Functional imaging of interleukin 1 beta expression in inflammatory process using bioluminescence imaging in transgenic mice. BMC Immunol. 2008 Aug 19;9:49. doi: 10.1186/1471-2172-9-49. PMID: 18710581; PMCID: PMC2529264.